重組膠原蛋白的產(chǎn)業(yè)發(fā)展歷程和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景展望
傅容湛1 , 范代娣1,2 通訊作者fandaidi@nwu.edu.cn, 楊婉娟3 , 陳亮3 , 曲詞4 , 楊樹林5 , 徐麗明3 通訊作者xuliming@nifdc.org.cn
摘要：重組膠原蛋白作為天然動(dòng)物組織膠原的替代物具有廣泛應(yīng)用于生物材料、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的潛力。種類繁多的重組膠原蛋白類型及其衍生體在多種表達(dá)系統(tǒng)中可實(shí)現(xiàn)一定規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，為探索和拓展重組膠原蛋白的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。文中簡(jiǎn)述了重組膠原蛋白的不同表達(dá)體系，如大腸桿菌、酵母、植物、昆蟲、哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞表達(dá)體系，重組膠原蛋白的優(yōu)勢(shì)及潛在的應(yīng)用和局限。著重介紹了目前重組膠原蛋白生產(chǎn)，包括不同表達(dá)體系的構(gòu)建策略和重組膠原蛋白羥基化修飾等方面的研究進(jìn)展，總結(jié)了重組膠原蛋白在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用及應(yīng)用基礎(chǔ)研究和應(yīng)用前景展望。
關(guān)鍵詞：重組膠原蛋白 重組類人膠原蛋白 重組膠原蛋白變體 重組蛋白表達(dá)體系 生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用
Industrial development and biomedical application prospect of recombinant collagen
FU Rongzhan1 , FAN Daidi1,2 Corresponding authorfandaidi@nwu.edu.cn, YANG Wanjuan3 , CHEN Liang3 , QU Ci4 , YANG Shulin5 , XU Liming3 Corresponding authorxuliming@nifdc.org.cn
Abstract: Recombinant collagen, as an alternative to natural collagen, has the potential to be widely used in biomaterials, biomedicine, etc. Diverse recombinant collagens and their variants can be industrially produced in a variety of expression systems, which lays a foundation for exploring and expanding the clinical application of recombinant collagens. We reviewed different expression systems for recombinant collagens, such as prokaryotic expression systems, yeast expression systems, as well as plant, insect, mammal, and human cell expression systems, and introduced the advantages, potential applications, and limitations of recombinant collagen. In particularly, we focused on the current progress in the recombinant collagen production, including recombinant expression system construction and hydroxylation strategies of recombinant collagen, and summarized the current biomedical applications of recombinant collagen.
Keywords: recombinant collagen recombinant human-like collagen protein recombinant collagen variant recombinant protein expression system biomedical application
膠原(collagen) 是指作為細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分的一大類蛋白質(zhì)，廣泛存在于所有組織和器官內(nèi)，包括皮膚、骨骼、肌腱、韌帶、軟骨和其他特定組織，為組織提供強(qiáng)度、耐久性和柔韌性[1-2]。膠原蛋白因其優(yōu)異的生物學(xué)功能、生物相容性和生物可降解等特性，成為生物材料和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域最廣泛使用的蛋白質(zhì)材料之一，包括美容填充材料[3]、藥物遞送系統(tǒng)[4]、手術(shù)縫合和組織工程支架[5-6]等。目前市面上廣泛使用的膠原材料主要是來源于動(dòng)物組織提取獲得的各種不同類型膠原蛋白。
大約30年前，研究人員開始使用重組DNA技術(shù)制備膠原蛋白的研究。在生物材料或生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，重組膠原蛋白已成為動(dòng)物源膠原蛋白材料的一種有吸引力的替代方法。重組膠原蛋白是通過將膠原蛋白的天然基因序列或重新優(yōu)化設(shè)計(jì)的基因序列，導(dǎo)入選定的宿主細(xì)胞中，如：大腸桿菌和酵母菌，經(jīng)過培養(yǎng)、發(fā)酵、分離純化等工藝，獲得的具有一定天然膠原蛋白特征和主要功能的蛋白質(zhì)。由于重組膠原蛋白分子單一、結(jié)構(gòu)清晰、易于控制，因此在生物醫(yī)學(xué)及組織工程領(lǐng)域具有很好的潛在應(yīng)用價(jià)值。此外，重組膠原蛋白技術(shù)可以用于無法從組織中規(guī)模獲取的膠原蛋白類型的大量生產(chǎn)及一些在其他動(dòng)物群體(包括鳥類和海洋物種) 中存在的獨(dú)特膠原蛋白類型的生產(chǎn)[7]。
根據(jù)重組膠原蛋白研究策略，目前可分為3類：(1) 重組人膠原蛋白(recombinant human collagen protein)，是指由DNA重組技術(shù)制備的，含有人膠原蛋白特定類型基因編碼的全長(zhǎng)(至少含有全部螺旋域) 或部分基因序列(至少含有螺旋域) 的重組蛋白，具有膠原蛋白理化性質(zhì)和生物學(xué)功能，但非必須具有三螺旋結(jié)構(gòu)；(2) 重組類人膠原蛋白(recombinant human- like collagen protein)，是指由DNA重組技術(shù)制備的，含有人特定類型或不同類型膠原蛋白基因編碼的部分序列，經(jīng)基因編輯、組合、拼裝、剪輯等制備的人膠原蛋白類似物，具有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，可無或有三螺旋結(jié)構(gòu)，具有膠原蛋白理化性質(zhì)和生物學(xué)功能；(3) 重組類膠原蛋白(recombinant collagen-like protein)，是指由DNA重組技術(shù)制備的，含有人特定或不同類型膠原蛋白部分基因編碼及人工設(shè)計(jì)的基因編碼，經(jīng)基因編輯、組合、拼裝等制備的膠原蛋白類似物，其基因編碼序列或氨基酸序列與人膠原蛋白的基因編碼序列或氨基酸序列同源性很低，但具有與膠原蛋白相似的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能。
重組膠原表達(dá)體系的選擇對(duì)于成功制備在結(jié)構(gòu)及性能上與生理性膠原蛋白類似的重組膠原蛋白至關(guān)重要。膠原蛋白的一些關(guān)鍵特征決定了其作為結(jié)構(gòu)和細(xì)胞信號(hào)分子的特性，包括由特定類型α鏈組成的熱穩(wěn)定三螺旋構(gòu)象，α鏈的正確翻譯后修飾，前肽的正確加工以及形成超分子組裝體的能力。這些關(guān)鍵特征除了依賴于膠原蛋白的自組裝，還很大程度上依賴于重組膠原表達(dá)體系中多種膠原修飾酶的存在。因此，選擇具有所需膠原修飾酶的表達(dá)體系是成功制備生產(chǎn)重組膠原蛋白的關(guān)鍵。目前多種表達(dá)系統(tǒng)被用于制備各種類型膠原蛋白、膠原蛋白片段和修飾的膠原蛋白變體，促進(jìn)了重組膠原蛋白產(chǎn)業(yè)長(zhǎng)足發(fā)展。本文主要對(duì)重組膠原蛋白的產(chǎn)業(yè)發(fā)展歷程，包括各種表達(dá)體系的開發(fā)和潛在應(yīng)用，以及亟待解決的問題進(jìn)行綜述。
1 重組膠原蛋白的表達(dá)體系
第一個(gè)用于制備重組膠原蛋白的表達(dá)體系是Fertala等[8]嘗試的具有表達(dá)天然膠原蛋白修飾酶活性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。該團(tuán)隊(duì)所制備的重組Ⅰ型和Ⅱ型前膠原具有正常的熱穩(wěn)定性，并且實(shí)現(xiàn)了正確的脯氨酸和賴氨酸殘基羥基化、正確的糖基化和前膠原N蛋白酶和C蛋白酶的加工；經(jīng)過適當(dāng)?shù)男揎椇兔复偬幚恚@些天然的重組膠原蛋白能夠組裝成組織良好的原纖維。但較低的產(chǎn)率和高成本是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系生產(chǎn)該類膠原蛋白的關(guān)鍵卡脖子問題，因此易于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的表達(dá)體系得到了充分的研究和發(fā)展，主要包括細(xì)菌、酵母和昆蟲細(xì)胞。此外，研究人員還研究了在包括煙草、大麥和玉米在內(nèi)的植物細(xì)胞，或在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺和轉(zhuǎn)基因雞的卵中制備重組膠原蛋白的可行性。表 1列舉了目前被使用的用于表達(dá)重組膠原蛋白的各種不同表達(dá)系統(tǒng)。
表 1 不同表達(dá)系統(tǒng)制備的重組膠原蛋白
| Expression system | Host cell | Collagen types | Hydroxylation | References |
| a. Expression systems containing endogenous proline-4-hydroxylase (P4H) activity | ||||
| Cell culture |
HT-1080 | Type Ⅰα1 chain | Endogenous | [9] |
| CHO cells | Type Ⅳ | Endogenous | [10] | |
| HEK293 cells | Type X | Endogenous | [11] | |
| Sf9 cells with baculovirus |
Type Ⅰ | Endogenous | [12] | |
| Type Ⅱ | Enhance Endogenous | [13-14] | ||
| Type Ⅲ | Endogenous | [15] | ||
| Type Ⅸ | Enhance endogenous | [16] | ||
| Type XIII | Endogenous | [17] | ||
| Transgenic animals | Mouse | Type Ⅰα1 | Endogenous | [18] |
| Type VII | Endogenous | [19] | ||
| Silkworm | Type Ⅲ fragment | Enhance endogenous | [20] | |
| b. Expression systems with no P4H activity | ||||
| Transgenic plants | Tobacco | Type Ⅰα1 | − | [21] |
| Corn | Type Ⅰα1 | − | [22] | |
| Barley | Type Ⅰα and type Ⅰα1 chain fragment | − | [23] | |
| Micro organisms | E. coli | Type 2 CB8, CB10 | − | [24] |
| Type Ⅰ | − | [25] | ||
| Type Ⅲα chain fragment | − | [26] | ||
| c. Expression systems with exogenous P4H activity | ||||
| Transgenic plants | Tobacco | Type Ⅰα1 | Exogenous | [21, 27] |
| Maize seed | Type Ⅰα1 | Exogenous | [28] | |
| Micro organisms |
P. pastoris | Type Ⅰ | Exogenous | [29-31] |
| Type Ⅲ | Exogenous | [29, 32] | ||
| Type Ⅱ | Exogenous | [33] | ||
| S. cerevisiae | Type Ⅰ | Exogenous | [34-35] | |
| H. polymorpha | Recombinant gelatin | Exogenous | [36] | |
| E. coli | Type Ⅲ | Exogenous | [24, 37-38] | |
表選項(xiàng)
1.1 原核生物(大腸桿菌) 表達(dá)體系
大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，其遺傳背景清晰，發(fā)酵成本低、生產(chǎn)周期短、效率高，可以快速大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白，具備規(guī)模化生產(chǎn)外源蛋白的潛力。大腸桿菌已被成功用于表達(dá)多種重組類人膠原蛋白，常見載體包括pGE、pET系列，盡管所表達(dá)的膠原蛋通常缺乏羥基化，仍能表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性[39]。范代娣教授團(tuán)隊(duì)[25,38]利用大腸桿菌表達(dá)發(fā)酵獲得的不同類型的重組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白(Mr分別為97、110、130 kDa) 其最高產(chǎn)量達(dá)14 g/L，構(gòu)建了不同類型和不同分子量的膠原蛋白分子庫。這些重組膠原蛋白已被用于研制人工血管、止血敷料、皮膚創(chuàng)傷修復(fù)材料、醫(yī)學(xué)美容、軟骨修復(fù)等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[40-42]。。王皓[43]在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)類人膠原蛋白基因COL6A2，重組類人膠原蛋白(Mr = 30 kDa) 表達(dá)量為34.2%。李瑛琦等[26]構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)菌株表達(dá)類人Ⅲ型膠原蛋白，并發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)提升類人Ⅲ型膠原蛋白(Mr = 13 kDa) 的產(chǎn)量可以達(dá)到3.02 g/L。楊霞[44]報(bào)道采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)一種單鏈重組類人膠原蛋白，由人Ⅲ型膠原蛋白肽段作為基本重復(fù)單元(30個(gè)氨基酸殘基) 重復(fù)16次后連接人膠原蛋白Ⅱ型肽段(10個(gè)氨基酸殘基) 為末端，通過發(fā)酵實(shí)現(xiàn)制備，但產(chǎn)量未見相關(guān)報(bào)道。
然而，大腸桿菌由于自身缺乏脯氨酸羥化酶，因此在單獨(dú)表達(dá)膠原蛋白時(shí)不能獲得羥基化的膠原蛋白，無法有效形成三螺旋結(jié)構(gòu)，進(jìn)而抑制天然結(jié)構(gòu)膠原分子到膠原纖維的自組裝。細(xì)菌體系表達(dá)重組膠原蛋白存在的羥基化問題可以通過轉(zhuǎn)導(dǎo)羥化酶來解決。唐云平等[24]將膠原蛋白部分編碼基因、人源脯氨酸羥化酶基因和D-阿拉伯糖-1, 4-內(nèi)酯酶基因在大腸桿菌中共表達(dá)，獲得了羥化的類人膠原蛋白(Mr = 35 kDa)，脯氨酸殘基羥基化率超過10%，產(chǎn)量為0.26 g/L。Rutschman等[37]在大腸桿菌中將人Ⅲ型部分膠原蛋白編碼基因(COL3A1) 與病毒來源的賴氨酰羥化酶L230基因和脯氨酸羥化酶L593基因共表達(dá)，制備獲得重組Ⅲ型類人膠原蛋白(Mr = 29 kDa) 具有與天然人膠原蛋白相似的羥基化水平，但由于其氨基酸序列與人膠原蛋白差異明顯，存在增加免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。雖然在大腸桿菌中可獲得羥化的類人膠原蛋白，但產(chǎn)量普遍不高，為滿足市場(chǎng)上對(duì)膠原蛋白的需求還須不斷的探索與改進(jìn)。
1.2 真核生物表達(dá)體系
1.2.1 酵母表達(dá)體系
酵母表達(dá)體系因其易于遺傳修飾，且具有合成翻譯后修飾和蛋白質(zhì)折疊所需酶的能力，理論上說也具有易高細(xì)胞密度發(fā)酵和低成本優(yōu)勢(shì)等優(yōu)點(diǎn)。迄今為止，利用酵母表達(dá)人膠原蛋白的研究較多，如畢赤酵母、漢遜酵母和釀酒酵母等，其中利用畢赤酵母工程菌表達(dá)獲得的重組人膠原蛋白的表達(dá)量和羥化效率最高。Myllyharju等[29-30]將人Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原蛋白編碼基因整合到含脯氨酸羥化酶的畢赤酵母工程菌中，獲得的重組膠原蛋白均能被充分羥基化，且通過持續(xù)供氧使產(chǎn)量達(dá)到0.2−0.6 g/L，獲得的人Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原蛋白的分子量為116−200 kDa。FibroGen公司采用該技術(shù)生產(chǎn)重組類人Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白，并應(yīng)用于止血?jiǎng)?/span>[38]和角膜再生材料[39]商業(yè)化產(chǎn)品的研發(fā)。范代娣教授課題組[31]在畢赤酵母GS115中實(shí)現(xiàn)了人Ⅰ型和Ⅲ型膠原α1鏈基因和脯氨酸-4-羥化酶基因共表達(dá)，實(shí)現(xiàn)羥化人Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白α1鏈(Mr = 130 kDa) (無N端前肽和C端前肽) 的高效生產(chǎn)，酵母體系重組膠原蛋白分別被用于研制創(chuàng)傷修復(fù)材料、注射凝膠類材料及軟骨修復(fù)類等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[40-42]。徐立群[45]表達(dá)了重組Ⅵ型膠原蛋白(Mr = 32 kDa)，為其活性功能的探討及其生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。楊樹林教授課題組[32,46-47]以人Ⅲ型膠原蛋白α1鏈編碼基因?yàn)槟０澹诋叧嘟湍讣?xì)胞中表達(dá)重組膠原蛋白(Mr = 55 kDa)，12.5 L發(fā)酵罐體系表達(dá)量為3.81 g/L。該團(tuán)隊(duì)生產(chǎn)的高純度(> 99%) 重組膠原蛋白已在醫(yī)用生物材料及組織工程領(lǐng)域開展了諸如生物多孔海綿支架[48]、敷料[49]、醫(yī)用納米纖維膜[50]及醫(yī)用水凝膠[51]等產(chǎn)品的研發(fā)。李佳佳等[33]和錢松等[52]分別在畢赤酵母SMD1168中實(shí)現(xiàn)編碼人Ⅰ型膠原蛋白α1和Ⅱ型膠原蛋白α1鏈的優(yōu)化基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了成熟全長(zhǎng)的人Ⅰ型膠原蛋白α1鏈(Mr = 97.15 kDa) 和成熟全長(zhǎng)Ⅱ型膠原蛋白α1鏈(Mr = 98.5 kDa) (均為包含N端前肽、三螺旋區(qū)域、C端前肽的成熟全長(zhǎng)氨基酸序列) 的高效生產(chǎn)表達(dá)。侯增淼等[53]基于人Ⅰ型膠原蛋白Gly-X-Y序列設(shè)計(jì)編碼親水性Gly-X-Y膠原肽段的核苷酸序列，構(gòu)建類人膠原蛋白畢赤酵母工程菌，獲得表達(dá)量達(dá)4.5 g/L，純度大于95%的重組類人膠原蛋白(Mr = 38 kDa)。總體而言，重組膠原蛋白能夠通過與脯氨酸-羥化酶在畢赤酵母中共表達(dá)實(shí)現(xiàn)充分的羥基化，且隨著發(fā)酵產(chǎn)量的逐步提高，具備了工業(yè)化生產(chǎn)前景。釀酒酵母也被許多人用來生產(chǎn)重組膠原蛋白。Chan等35]設(shè)計(jì)了含有脯氨酰羥化酶的釀酒酵母可制備Ⅲ型膠原蛋白(Mr = 190和270 kDa)，但脯氨酸羥基化水平約0.5%，顯著低于天然人膠原蛋白。Vaughn等[54]采用不同的克隆策略提升了Ⅲ型膠原蛋白(Mr = 30和60 kDa) 的羥基化水平，但仍低于天然膠原蛋白。
雖然酵母重組人膠原蛋白與天然人膠原蛋白相似度更高，但多為同源三聚體。然而，相對(duì)更難表達(dá)的異源三聚體膠原，如人Ⅰ型膠原，由于其在組織中含量最高、被研究報(bào)道得最多，同時(shí)科學(xué)界對(duì)其性能安全性了解最清晰，因此在生物醫(yī)藥或組織工程等領(lǐng)域比同源三聚體膠原，如Ⅱ和Ⅲ型膠原，具有更廣泛的潛在應(yīng)用前景。Toman等采用優(yōu)化克隆表達(dá)脯氨酰羥化酶兩個(gè)亞單位的在釀酒酵母，成功制備人Ⅰ型膠原蛋白α1鏈和α2鏈，其α1鏈和α2鏈比例與天然Ⅰ型膠原具有的比例(2︰1) 相似[34]。Olsen等通過去除對(duì)于Ⅰ型膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)非必需的N-和C-區(qū)域，提高釀酒酵母生產(chǎn)重組人Ⅰ型膠原蛋白的產(chǎn)量[55]。
1.2.2 植物表達(dá)體系的構(gòu)建
重組膠原蛋白已經(jīng)在幾種植物系統(tǒng)中被成功表達(dá)，如玉米(Zea mays) 和煙草植物(Nicotiana tabacum) 中的植物細(xì)胞[21,27]，通過與羥基化酶共表達(dá)能夠產(chǎn)生重組Ⅰ型膠原同源三聚體(Mr = 70.0–120.0 kDa)，但通常存在著外源蛋白表達(dá)量低等問題。Merle等[27]通過共表達(dá)人Ⅰ型膠原蛋白α1鏈基因和嵌合的P4H基因至煙草植株，成功制備羥基化的同源三聚體重組Ⅰ膠原蛋白(Mr = 120.0 kDa)。這是第一次在煙草中運(yùn)用瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，共表達(dá)動(dòng)物細(xì)胞來源修飾酶，以提高植物中重組蛋白的質(zhì)量。Eskelin等[23]以大麥種子作為宿主，表達(dá)了人Ⅰ型膠原蛋白的α1鏈(Mr = 45 kDa) 和4.5×104片段，其中4.5×104片段的產(chǎn)量達(dá)到150 g/ha，有商業(yè)應(yīng)用前景。Stein等[21]在煙葉中將人Ⅰ型膠原蛋白α1鏈和α2鏈編碼基因、人源脯氨酸羥化酶和賴氨酸羥化酶基因進(jìn)行共表達(dá)(Mr = 170.0 kDa)，產(chǎn)量為20 g/L，且羥脯氨酸和羥賴氨酸的含量分別為7.55%和0.74%，羥基化程度與天然人Ⅰ型膠原蛋白非常接近，該技術(shù)已被Collplant公司(耐斯茲敖那，以色列) 用來商業(yè)化生產(chǎn)重組Ⅰ型人膠原蛋白用于臨床應(yīng)用的產(chǎn)品中，據(jù)報(bào)道用于傷口敷料凝膠(VergenixFG) [56-58]和用于肌腱治療相關(guān)材料(VergenixSTR) 中[59]。
1.2.3 昆蟲表達(dá)系統(tǒng)
昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(baculovirus expression vector systems, BEVS) 由桿狀病毒表達(dá)載體和病毒感染的昆蟲宿主組成的二元表達(dá)系統(tǒng)，由于其可以對(duì)真核蛋白進(jìn)行翻譯后加工等過程而被廣泛地用于真核基因的體外表達(dá)。而且昆蟲是桿狀病毒的自然宿主，不會(huì)感染其他動(dòng)物、植物及人類，具有較高的安全性。Nokelainen等[13]構(gòu)建了兩株桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，其中一株編碼Ⅱ型膠原α鏈，另一株編碼人P4H的α和β亞基，共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞后，成功表達(dá)了具有穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的人Ⅱ型膠原蛋白(Mr = 120.0 kDa)，表達(dá)量達(dá)50 mg/L。齊琦等[14]研究了利用重組桿狀病毒多基因表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)人Ⅱ型膠原蛋白全序列。利用重組病毒BmNPV-ColⅡ-IM注射5齡起家蠶幼蟲，得到的重組人Ⅱ型膠原蛋白(Mr = 300.0 kDa) 可高達(dá)約1 mg/頭。但是，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)也存在著一定的缺陷，例如無法連續(xù)表達(dá)異源蛋白，無法產(chǎn)生復(fù)雜的糖基側(cè)鏈。分離的昆蟲細(xì)胞也被用作重組膠原蛋白表達(dá)系統(tǒng)，如由甘藍(lán)夜蛾(Trichoplusia ni) 獲得的克隆High FiveTM (HF) 昆蟲細(xì)胞。在沒有重組脯氨酸-羥化酶P4H的情況下，HF細(xì)胞能夠表達(dá)含4-羥基脯氨酸的重組人Ⅲ型膠原蛋白，但熱穩(wěn)定性較低。添加重組脯氨酸-羥化酶P4H或在培養(yǎng)基中添加抗壞血酸均可提升膠原的羥基化水平和熱穩(wěn)定性[16]。
Tomita等[15]構(gòu)建了膠原蛋白表達(dá)載體，并采用基因植入方法，通過轉(zhuǎn)基因蠶的絲腺分泌表達(dá)人Ⅲ型膠原蛋白片段(Mr = 53、75和88 kDa)，長(zhǎng)度約為天然人Ⅲ型膠原蛋白全長(zhǎng)的1/5，含量約為占蠶繭干重的1%，且脯氨酸羥基化不充分。Adachi等[20]采用多基因共表達(dá)技術(shù)實(shí)現(xiàn)Ⅰ型膠原蛋白α1鏈和高活力脯氨酸羥基化酶P4H的共表達(dá)，轉(zhuǎn)基因蠶的P4H活力是野生型的130倍，利用轉(zhuǎn)基因蠶的中部絲腺分泌表達(dá)人Ⅰ型膠原蛋白α1鏈，表達(dá)量提高到蠶繭干重的8%，但所表達(dá)的人Ⅰ型膠原蛋白鏈(Mr = 120.0 kDa) 缺乏羥脯氨酸，不能形成三螺旋結(jié)構(gòu)。
1.2.4 哺乳動(dòng)物或人細(xì)胞表達(dá)體系
利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，重組DNA可以被導(dǎo)入受精卵整合到宿主基因組中，實(shí)現(xiàn)重組膠原蛋白在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物各組織和器官中的表達(dá)。John等[60]在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中表達(dá)了完全羥基化的重組膠原蛋白(Mr = 60 kDa)。Toman等[18]在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺內(nèi)成功表達(dá)了可分泌、可溶性、具有螺旋結(jié)構(gòu)的人Ⅰ型原膠原同源三聚體(Mr = 160 kDa)，表達(dá)量高達(dá)8 mg/mL。Hou等[19]]在中國倉鼠卵巢內(nèi)表達(dá)人Ⅶ型膠原蛋白(Mr = 290 kDa)。多種人類細(xì)胞系，包括纖維肉瘤細(xì)胞(HT-1080) 和胚胎腎細(xì)胞(293- EBNA) 被成功用于制備重組人膠原蛋白Ⅰ型、Ⅴ型(Mr = 120和250 kDa) 和Ⅶ型(Mr = 290 kDa) [9,61-63]。然而，目前細(xì)胞表達(dá)體系制備重組膠原蛋白因產(chǎn)量低不能滿足工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的需求。而轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物是重組人膠原蛋白可能的高產(chǎn)來源。
2 重組膠原蛋白衍生體研究進(jìn)展
重組膠原蛋白表達(dá)體系關(guān)鍵技術(shù)研究為生產(chǎn)具有修飾序列的定制重組膠原蛋白變體開辟了機(jī)會(huì)，如短膠原衍生肽。雖然目前商業(yè)應(yīng)用主要集中于基于天然膠原蛋白編碼基因制備的重組膠原蛋白，但膠原蛋白衍生體因其具有定制特征，如熱穩(wěn)定性和與特定配體相互作用能力，將來可能具有更明顯的優(yōu)勢(shì)和廣泛的應(yīng)用前景。
膠原衍生肽的三螺旋結(jié)構(gòu)通常不穩(wěn)定(熱變性溫度Tm 30−60 ℃)，在體溫下會(huì)展開，因此需要采用多種技術(shù)來提高其穩(wěn)定性。將膠原蛋白衍生序列與三螺旋穩(wěn)定化Gly-Pro-Pro重復(fù)序列相接[64-66]，或?qū)⒛繕?biāo)肽與穩(wěn)定序列雜交可維持其三螺旋結(jié)構(gòu)[67]；將膠原蛋白衍生序列與噬菌體T4纖維蛋白的foldon域片段相連[68-69]，由于foldon域片段具有形成三聚體的天然能力，因此能夠有效地穩(wěn)定由短膠原肽組裝形成的三螺旋結(jié)構(gòu)。此外，研究人員還探索了與細(xì)菌衍生的三螺旋肽融合的短膠原蛋白樣片段的可能性。細(xì)菌衍生的三螺旋肽盡管不含羥脯氨酸殘基，但在高溫下仍可保持穩(wěn)定的三重螺旋結(jié)構(gòu)(熱變性溫度Tm約為89 ℃)。由于其較好的穩(wěn)定性、生物相容性和大規(guī)模生產(chǎn)潛力，細(xì)菌膠原蛋白在某些生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。盡管上述方法顯著提升了短膠原片段的穩(wěn)定性，但是非天然序列的存在可能導(dǎo)致材料獲得臨床批準(zhǔn)變得更復(fù)雜，因此可基于短膠原片段設(shè)計(jì)正常長(zhǎng)度的膠原蛋白樣結(jié)構(gòu)，包含短天然域的串聯(lián)重復(fù)序列，或?qū)⒍探Y(jié)構(gòu)域連接到長(zhǎng)度與天然膠原蛋白相匹配的分子中，并使其形成三螺旋結(jié)構(gòu)的能力。小部分這類構(gòu)造的材料能夠保留聚集為纖絲結(jié)構(gòu)的能力，但大部分則無法有效形成適當(dāng)?shù)睦w絲，其中一些材料的熱穩(wěn)定性較低，這些都阻礙了其在組織工程中的應(yīng)用[70]。此外，雖然新的串聯(lián)重復(fù)膠原蛋白衍生體已被作為研究工具，用于定位膠原特異性受體的結(jié)合域，定義驅(qū)動(dòng)原纖維形成的區(qū)域以及作為治療性細(xì)胞的遞送載體等，但目前尚未在臨床上應(yīng)用[71-73]。
3 重組膠原蛋白的優(yōu)勢(shì)及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用
3.1 重組膠原蛋白的優(yōu)勢(shì)
重組膠原蛋白相比于傳統(tǒng)方法提取的動(dòng)物源性膠原，水溶性更好，可加工性能更強(qiáng)，并且具有組分單一、制備過程可控、生產(chǎn)周期短等特征，產(chǎn)品品質(zhì)也更容易控制。因此，重組膠原蛋白在生物材料和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景。重組膠原蛋白的優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在：(1) 通過基因工程手段在不影響膠原蛋白功能的條件下增加其親水性氨基酸的含量，從而提高重組膠原蛋白的親水性，使它們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中，特別是組織工程材料構(gòu)建過程中更易于使用。(2) 重組單鏈結(jié)構(gòu)膠原具有更多的活性結(jié)合位點(diǎn)，即便是三螺旋結(jié)構(gòu)的重組膠原蛋白也會(huì)比天然人組織膠原結(jié)構(gòu)更為松散，暴露出更多生物活性區(qū)域，易于與細(xì)胞或其他生物活性分子間發(fā)生相互作用，在許多方面可能表現(xiàn)出更強(qiáng)的生物活性。例如，重組膠原蛋白具有更強(qiáng)的促成纖維細(xì)胞募集、粘附、增殖和遷移的能力，在皮膚修復(fù)及皮膚組織工程領(lǐng)域展現(xiàn)出更強(qiáng)的功能性；(3) 對(duì)于具有催化氧化反應(yīng)特性的金屬離子如鐵、銅、汞、鎘，具有更強(qiáng)的螯合能力，從而發(fā)揮更優(yōu)異的抗氧化特性、減少皮膚氧化損傷和美白的作用；(4) 強(qiáng)化了膠原蛋白富集血小板和凝血因子的能力，表現(xiàn)出更優(yōu)異的止血與促傷口愈合能力[74]。(5) 通過重組技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)膠原蛋白分子進(jìn)行理性設(shè)計(jì)和改造，生產(chǎn)天然膠原蛋白的新變體，例如，具有更多數(shù)量或種類活性官能團(tuán)的新膠原蛋白分子、具有多重復(fù)特定功能結(jié)構(gòu)域的新膠原蛋白序列，以及基于膠原與其他類型分子(如生長(zhǎng)因子) 的新嵌合構(gòu)建體。針對(duì)特定應(yīng)用需求實(shí)現(xiàn)膠原蛋白的理性設(shè)計(jì)和合成，進(jìn)一步強(qiáng)化膠原蛋白的功能性，以適應(yīng)食品、化妝品、生物材料等不同領(lǐng)域的應(yīng)用需求。
3.2 重組膠原蛋白的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用
重組膠原蛋白已經(jīng)被廣泛用于制備適用于不同用途的生物醫(yī)用材料，包括組織修復(fù)工程、藥物遞送和蛋白質(zhì)替代療法等。通過運(yùn)用多種制備方法，重組膠原蛋白及其片段被制成多種類型的3D材料，如多孔海綿、纖絲和膜等，以更好地支持細(xì)胞附著和生長(zhǎng)。例如，引入化學(xué)交聯(lián)穩(wěn)定膠原蛋白材料，使其可以在體溫下發(fā)揮作用；使用靜電紡絲和磁對(duì)準(zhǔn)等多種技術(shù)形成膠原纖絲結(jié)構(gòu)材料[75-78]。范代娣團(tuán)隊(duì)[79-80]報(bào)道多種新型重組膠原蛋白水凝膠體系，應(yīng)用于皮膚燒傷或慢性傷口治療的臨床研究，發(fā)現(xiàn)其治療效果顯著優(yōu)于臨床使用的傳統(tǒng)材料，證明重組膠原蛋白材料對(duì)于傳統(tǒng)組織工程技術(shù)制備的臨床產(chǎn)品具有替代性。可注射溫敏型重組膠凝膠材料可以直接在受傷部位創(chuàng)建具有適當(dāng)形狀的組織支架，同時(shí)還具有藥物、細(xì)胞輸送和可控釋放能力。例如，Confalonieri等采用一種市售的含有RGD序列的重組膠原蛋白肽構(gòu)建微球材料，支持間充質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)[81]。。范代娣團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)開發(fā)出系列基于重組膠原蛋白的水凝膠材料應(yīng)用于多種受損組織的修復(fù)與再生，包括皮膚[42]、軟骨[82-84]等。Yang等利用重組Ⅲ型膠原蛋白制備三維多孔支架及水凝膠材料已被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用研究中[85-86]。
隨著新型支架材料制造技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，包括纖維排列電紡方法和3D打印技術(shù)等，使得構(gòu)建有組織的支架材料以及包括細(xì)胞在內(nèi)的組織狀生物打印結(jié)構(gòu)成為可能[87-89]。例如，楊樹林團(tuán)隊(duì)采用靜電紡絲法構(gòu)建重組Ⅲ型膠原蛋白醫(yī)用雙層人造血管[90]及利用活體細(xì)胞3D打印技術(shù)制備人造眼角膜[91]。但是，目前大多數(shù)重組膠原蛋白材料的研究主要在簡(jiǎn)單地定義重組膠原蛋白的基本用途，缺少更深入的關(guān)于重組膠原蛋白的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)特性、穩(wěn)定性、異質(zhì)性等質(zhì)量研究和基于重組膠原蛋白醫(yī)療產(chǎn)品的功效機(jī)制及其臨床應(yīng)用研究。
3.3 重組膠原蛋白在蛋白質(zhì)替代療法中的潛在應(yīng)用
重組膠原蛋白可用于潛在的蛋白質(zhì)替代療法，治療多種涉及遺傳或獲得性膠原缺陷等嚴(yán)重疾病，盡管這些疾病有非常高的異質(zhì)性，沒有明確的基因型與表型的相關(guān)性，但大多數(shù)都是由于基因突變導(dǎo)致的膠原蛋白減少[92]。迄今為止，膠原蛋白替代療法的研究大多集中在影響皮膚和腎臟基底膜的疾病上，Ⅶ型膠原蛋白主要針對(duì)皮膚底膜的疾病，Ⅳ型膠原蛋白主要針對(duì)腎臟基底膜的疾病[19,93]。
隱性營養(yǎng)不良大皰性表皮松解癥(recessive dystrophic epidermolysis bullosa, RDEB) 是一種因?yàn)榛蛲蛔儺a(chǎn)生了過早的終止密碼子，從而完全阻止膠原的生物合成，導(dǎo)致Ⅶ型膠原蛋白完全缺失引發(fā)的水皰性皮膚病。RDEB的進(jìn)行性會(huì)導(dǎo)致皮膚過度損傷、疤痕、攣縮和手指融合，甚至可能發(fā)展為鱗狀細(xì)胞癌[94]。迄今為止，研究人員已經(jīng)測(cè)試了將正常Ⅶ型膠原蛋白引入患病組織的幾種方法：(1) 通過遞送編碼正常膠原蛋白Ⅶ鏈的COL7A1基因進(jìn)行蛋白質(zhì)替代療法；(2) 直接遞送重組膠原Ⅶ的蛋白[95]。
考慮到Ⅶ型膠原蛋白的直接遞送，Remington等[96]將重組Ⅶ型膠原蛋白直接注射到Ⅶ型膠原蛋白缺陷小鼠的皮膚中，觀察到Ⅶ型膠原蛋白在真皮基底膜區(qū)域的特定部位蓄積并形成了膠原蛋白Ⅶ組裝體，即錨定纖維，但并未觀察到抗Ⅶ型膠原蛋白Ⅰ抗體的形成。另一項(xiàng)研究中，重組Ⅶ型膠原蛋白被注射到無Ⅶ型膠原蛋白的小鼠的血液中，與在小鼠皮內(nèi)注射的結(jié)果一樣，外源重組Ⅶ型膠原蛋白能夠聚集在適當(dāng)?shù)慕M織位置，包括真皮與表皮的交界處、舌頭和食道[19]。盡管已取得這些令人鼓舞的初步結(jié)果，但采用直接遞送重組Ⅶ型膠原蛋白以改善RDEB患者組織結(jié)構(gòu)完整性的治療方案并未從實(shí)驗(yàn)室的研究階段轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用中。Phoenix Tissue Repair公司開始了治療Ⅶ型膠原突變的RDEB患者的臨床試驗(yàn)，以確定膠原蛋白替代療法的安全性和有效性[97]。如果成功可能也會(huì)為其他膠原類型突變引起的疾病使用替代療法提供可能性。
目前蛋白質(zhì)替代療法的發(fā)展仍然受許多問題制約。(1) 存在于溶液中的Ⅶ型膠原蛋白(人體中最大的已知蛋白質(zhì)之一) 的斯托克斯半徑很大，因此，Ⅶ型膠原蛋白或其他膠原蛋白類型不可能輕易擴(kuò)散到靶組織部位，并且高親和性Ⅶ型膠原蛋白間的結(jié)合作用加速了不希望的聚集現(xiàn)象。(2) Ⅶ型膠原蛋白必須通過自組裝形成功能性錨定纖維，這類復(fù)雜的過程不太可能在經(jīng)皮或靜脈內(nèi)注射遞送的外源性Ⅶ型膠原蛋白上發(fā)生。Supp等[98]的最新研究也支持這一觀點(diǎn)：要使錨定纖維在真皮-表皮交界內(nèi)正確形成并發(fā)揮功能，表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞都必須產(chǎn)生Ⅶ型膠原蛋白。(3) Ⅶ型膠原蛋白的半衰期。Kühl等[99]證明Ⅶ型膠原蛋白的半衰期約為1個(gè)月，因此為取得有積極意義的長(zhǎng)期作用必須頻繁地大量注射。(4) 靜脈注射Ⅶ型膠原蛋白的血小板聚集作用。盡管體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，Ⅶ型膠原蛋白不像形成纖維的膠原蛋白那樣強(qiáng)烈聚集血小板，但不能排除血液中的膠原蛋白Ⅶ觸發(fā)血凝塊形成的可能性[100]。。而且其他類型膠原蛋白的蛋白質(zhì)替代療法在臨床應(yīng)用時(shí)也可能會(huì)遇到類似問題。例如，通過局部或全身途徑輸送Ⅳ型膠原蛋白治療Alport綜合征[96]，到目前為止仍未確定這種方法的有效性，也并未解決其引起的血小板聚集、擴(kuò)散和激活等問題。
重組膠原蛋白替代療法治療膠原基因突變引起的疾病時(shí)，治療時(shí)間的選擇是需要考慮的另一個(gè)關(guān)鍵因素。如果膠原蛋白是用于形成早期胚胎發(fā)育的組織模板，僅通過產(chǎn)后遞送重組膠原蛋白是否能夠在其靶組織恢復(fù)并維持功能尚不清楚。例如，在Ⅱ型膠原蛋白突變引起的脊椎骨骺發(fā)育不良的小鼠模型中，只有在胚胎早期干預(yù)才能恢復(fù)正常的骨骼組織。相反，在胚胎后期和產(chǎn)后干預(yù)則無法改善這些組織的病程[101-102]。
4 重組膠原蛋白臨床研究現(xiàn)狀及展望
盡管人們針對(duì)具有天然結(jié)構(gòu)和膠原衍生結(jié)構(gòu)的重組膠原蛋白已成功開發(fā)設(shè)計(jì)出多種生產(chǎn)系統(tǒng)，包括不同的生物，如細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因植物。但是所獲得的重組膠原蛋白到目前為止還僅限于少數(shù)產(chǎn)品在臨床上開始應(yīng)用，主要的原因可能包括以下幾點(diǎn)。
(1) 目前研發(fā)重組膠原蛋白的生產(chǎn)系統(tǒng)包括：細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因植物等，但由于制造技術(shù)的難度和膠原蛋白大分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，使得能夠大規(guī)模生產(chǎn)重組膠原蛋白的企業(yè)，尤其是能規(guī)模制備滿足臨床需求品質(zhì)的重組膠原的企業(yè)并不多。
(2) 雖然可以通過重組技術(shù)生產(chǎn)不同類型膠原蛋白，這也是重組技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)之一，目前重組技術(shù)能進(jìn)行規(guī)模制備的膠原主要是單鏈結(jié)構(gòu)膠原，單鏈結(jié)構(gòu)膠原蛋白具有更靈活的自組裝形式及與細(xì)胞基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)等優(yōu)勢(shì)。這種組裝有些可逆有些不可逆，例如在某種溫度條件下觀測(cè)到單鏈重組膠原蛋白可呈現(xiàn)出生理膠原的光譜學(xué)性質(zhì)，但升高或降低溫度這種性狀消失，范代娣團(tuán)隊(duì)研發(fā)的一種重組膠原蛋白在溫度低于15 ℃時(shí)呈現(xiàn)6聚體纖維結(jié)構(gòu)，升高溫度則自動(dòng)解聚，長(zhǎng)纖維變成短棒狀，在體內(nèi)生理?xiàng)l件下也是一種單鏈結(jié)構(gòu)，說明它是一種條件弱交聯(lián)組裝，而有的組裝是不可逆的，如在一些射線等作用下的組裝交聯(lián)，在解除條件后其理化性能仍然維持其強(qiáng)組裝不可逆性狀。正是由于重組膠原蛋白具有多種形式和活性結(jié)合位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，使以其為原料的組織工程醫(yī)療產(chǎn)品獲得令人鼓舞的臨床前結(jié)果[81-82,103]。單鏈結(jié)構(gòu)膠原因?yàn)榉浅：玫目伤苄浴⒖杉庸ば浴⒖审w外自組裝等使得它更優(yōu)于已經(jīng)組裝成天然高級(jí)結(jié)構(gòu)的動(dòng)物膠原蛋白，但缺點(diǎn)是發(fā)酵產(chǎn)生的單鏈結(jié)構(gòu)膠原在純化及處于微生物復(fù)雜酶系時(shí)容易降解，所以純化成本居高不下。
(3) 基于蛋白材料結(jié)構(gòu)需求進(jìn)而通過理性設(shè)計(jì)獲得膠原蛋白序列并進(jìn)行重組表達(dá)生產(chǎn)，可以獲得一系列在安全性、功效性方面更好的類膠原衍生體，而這方面的臨床研究需要更嚴(yán)格的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)及監(jiān)管部門擔(dān)心的未知風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，因此導(dǎo)致了重組膠原家族臨床應(yīng)用的慢進(jìn)程。
(4) 由于動(dòng)物膠原易于從動(dòng)物的組織中分離獲得，因此其產(chǎn)品價(jià)格比需要更先進(jìn)技術(shù)生產(chǎn)的重組膠原蛋白具有優(yōu)勢(shì)；因此動(dòng)物膠原蛋白很可能仍會(huì)繼續(xù)為生物醫(yī)學(xué)、制藥、食品和化妝品等行業(yè)提供大量所需原料。
(5) 組織工程產(chǎn)品是重組膠原蛋白材料的理想應(yīng)用領(lǐng)域，但是，由于重組膠原蛋白可能在表達(dá)過程中存在異質(zhì)型、非完全生理性人膠原結(jié)構(gòu)或新結(jié)構(gòu)蛋白等，如不同類型的異質(zhì)性或程度及是否會(huì)影響或者多大程度地影響產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能等都需要全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。而對(duì)于一些特殊用途必須需要制備成天然結(jié)構(gòu)膠原蛋白時(shí)，重組膠原蛋白的應(yīng)用將受限于其翻譯后修飾水平低、糖基化、羥基化程度不高等限制。相信隨著合成生物學(xué)、蛋白質(zhì)工程技術(shù)等的快速發(fā)展，探索膠原蛋白高效合成路徑和特定修飾關(guān)鍵酶、發(fā)酵和純化工藝優(yōu)化等方法，有望推動(dòng)降低成本、高修飾水平的多種類型重組膠原蛋白的研發(fā)。多種新興技術(shù)的運(yùn)用，有望進(jìn)一步拓展重組膠原蛋白的構(gòu)建和加工技術(shù)，同時(shí)降低生產(chǎn)成本。
總之，重組膠原蛋白以其優(yōu)異的生物相容性、多功能性、可擴(kuò)展性和品質(zhì)可控等特性，是膠原蛋白家族的直接來源，尤其是生物相容性良好的新生物功能材料領(lǐng)域最大的來源之一。目前不同類型重組膠原蛋白的生產(chǎn)雖然受到表達(dá)體系、產(chǎn)量、成本等問題的制約，但未來隨著技術(shù)進(jìn)步，重組膠原將為生物材料或生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域提供臨床安全性高、多樣化、不同生物學(xué)功效的膠原蛋白原料。
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